质粒转染_质粒转染步骤

材料试剂：胰化蛋白胨，酵母提取物，琼脂，NaCl，NaOH（调 pH），氨苄青霉素，卡那 霉素，质粒提取试剂盒仪器：高压灭菌锅，42℃恒温水浴锅

 

材料试剂：胰化蛋白胨，酵母提取物，琼脂，NaCl，NaOH（调pH），氨苄青霉素，卡那 霉素，质粒提取试剂盒仪器：高压灭菌锅，42℃恒温水浴锅，，恒温摇床（37℃,225rpm），无菌培养板，消毒 1.5ml 离心管，消毒枪头，无菌操作台

实验步骤：1. LB 培养基的配制：在 950 ml 去离子水中加入: 胰化蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g摇 动容器直至溶质溶解.用 5mol/LNaOH 调 pH 至 7.0.用去离子水定容至 1L.在 15psi 高 压下蒸汽灭菌 20min.

固态培养基LB 固体培养基及倒板：（1）.配制：100mlLB 培养基加入 1.5g 琼脂粉（2）.抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的 LB 固体培养基置与 55℃的水浴中，待培 养基温度降到55℃时（手可触摸）加入氨苄抗生素（终浓度为50μg/ml），以免温度过 高导致抗生素失效，并充分摇匀。

（3）.倒板：一般 10ml 倒 1 个板子培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟（4）.保存：用封口胶封边，并倒置放于4℃保存，一个月内使用2. 从-70℃冰箱中取 200μl 感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。

3. 加入质粒 DNA 溶液（含量不超过 50ng，体积不超过 10μl），轻轻摇匀，冰上放置 30分钟后4. 42℃水浴中热击 45s/90s，热击后迅速置于冰上冷却 3-5 分钟5.向管中加入 1ml LB 。

液体培养基（不含 Amp），混匀后 37℃振荡培养 1 小时，使细菌恢 复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr）6.将上述菌液摇匀后取 100μl 涂布于含 Amp 的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌 液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养 16-24 小时。

同时做两个对照：对照组 1：以同体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液，其它操作与上面相同此组正常情 况下在含抗生素的 LB 平板上应没有菌落出现对照组 2： 以同体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液，但涂板时只取 5μl菌液涂布于不 含抗生素的 LB 平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。

大肠杆菌的扩增1. 从 LB 平板上挑取新活化的单个菌落，接种于 3-5ml LB 液体培养基中，37℃下振荡 培养 12 小时左右，直至对数生长后期将该菌悬液以 1：100-1：50的比例接种 于 100ml LB 液体培养基中，37℃振荡培养 2-3 小时至 OD600 ＝0.5 左右。

2. 取上述培养液置于冰中 10min，之后转移到已灭菌的 50ml 离心管中再于冰上放置5min3. 于 4℃离心，2700rmp，10min，弃上清，收集细菌4. 质粒的提取准备大肠杆菌质粒提取盒和扩增的带质粒大肠杆菌培养液

5. 质粒鉴定（琼脂糖凝胶电泳）质粒转染细胞株材料细胞株、质粒、培养基、链霉素/青霉素（双抗）、FCS（小牛血清）、PBS（磷酸盐缓冲溶液）、胰酶/EDTA 消化液、转染试剂（Lipofectamine TM2000

）实验步骤Ⅰ.准备细胞：贴壁细胞：转染前24h，在500µL 无双抗完全培养基中接种0.5-2×105 个细胞， 转染时细胞融合度为80-90%(注：铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞 堆积生长)II ．对于每个转染样品，按下面的方法准备：

（1）用50µL Opti-MEM 稀释0.8µg 质粒DNA，轻轻吹吸3- 5次混匀，室温下 静置 5min（2）轻轻颠倒混匀转染试剂，用 50 µL Opti-MEM 稀释 2.0 µL LipofectamineTM2000，轻轻吹吸 3 - 5 次混匀，室温下静置 5 min。

（3）混合转染试剂和质粒 DNA 稀释液，轻轻吹吸 3 - 5 次混匀，室温下静置20 min注:转染复合物一旦形成，应立即加入培养皿中进行细胞转染（4）转染复合物加入到 24 孔细胞板中，100 µL/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。

（5）将细胞板置于37℃、5%CO2 培养箱中培养 6h 左右，进行换液，换成含 10% 血清的普通培养基，在 37℃，5％CO2 孵育箱中继续培养 24h 左右 稳定转染细胞株的筛选（各种细胞用什么抗生素筛选呢）。

从 37℃，5％CO2 孵育箱中取出培养皿，弃去含转染试剂的培养基，用 PBS 冲洗细胞 2 遍，胰蛋白酶消化，接种 1/2 的细胞到 100 mm 培养皿中，加入含 500 µg/ml G418 的 新鲜培养基，每 2-3 天更换一次新的筛选培养基，每天观察细胞的死亡情况。

当正常细胞完全死亡后，换用新的不含 G418 的培养基培养每天观察细胞生长状态在细胞达到60%汇合率时再用含 500 µg/ml G418 的培养基筛选一次当细胞达到 90%以上汇合率时将细 胞转移至培养瓶中继续培养（转染后 10-12 天左右）。

以后每隔 4-5 天再用含 500µg/ml G418 的培养基筛选直到稳定表达转染质粒的细胞达到一定数量后可以收集样品（约转染 后 15 天左右）以后继续培养时加入的 G418 浓度降一半