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药材购置于不同产地，15批药材来源见表1，均由四川省中医药科学院舒光明研究员鉴定，天冬为百合科天冬属植物天冬Asparagus cochinch

 

经典名方是中医发展和历代医家临床实践的结晶，凝结着各代医家的智慧，开发与研究经典名方既有利于传承中医文化，有利于现代中医药的发展2018年，国家中医药管理局公布了《古代经典名方目录（第一批）》[1]，二冬汤被收录于其中。

二冬汤出自清代程国彭所著的《医学心悟》卷三[2]，全方由天冬、麦冬、天花粉、黄芩、知母、甘草、人参、荷叶组成，主治上消，具有养阴清热、生津止渴之功效，临床上常被用于治疗糖尿病、百日咳、肺结核、慢性支气管炎、阴虚咳嗽等

[3-8]因中药具有多成分、多靶点的特点，检测其任何一种成分均不能代表其整体药效，且由于中药的复杂性导致中药质量控制指标与其有效性关联度低且专属性差等问题，因此刘昌孝院士[9]于2016年首次提出了质量标志物（quality markers，Q-Marker）的概念，旨在更好地控制中药材的质量。

[10]而中药指纹图谱能全面、定量地分析中药所包含的化学信息，是中药质量控制的重要手段，同时在经典名方物质基准的研究中也成为重要手段[11]网络药理学具有整体性、系统性的特点与中医药整体观、辨证论治原则一致，其通过建立“成分-靶点-通路”网络拓扑学关系图可以直观反映药物发挥药效的特点，增加复方临床应用的科学性。

[12]本研究将指纹图谱与网络药理学相结合，并应用相似度评价软件和聚类分析，可以更加系统、全面地对其质量进行控制，预测其发挥药效的潜在Q-Marker，并同时分析指纹图谱的质量控制指标是否合理，可为二冬汤后续研究提供可行性参考。

1 仪器与材料1.1 仪器Agilent 1260高效液相色谱仪，美国Agilent公司；Sigma TGL-16G型高速冷冻离心机，Sigma公司；SB-XS205型电子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；2L液体加热器，康雅顺公司。

1.2 材料芒果苷、金丝桃苷、黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸铵对照品，中国食品药品检定研究院，批号分别为110607-201704、111521-201809、110715-202122、112002-2-1702、110731-201910，质量分数依次为98.1%、94.9%、94.2%、98.0%、98.0%；新芒果苷、千层纸素-3-

O-β-D-葡萄糖醛酸苷对照品，四川德思特乐美天有限公司，批号分别为DST201128-017、DST200802-040，质量分数均为98.0%药材购置于不同产地，15批药材来源见表1，均由四川省中医药科学院舒光明研究员鉴定，天冬为百合科天冬属植物天冬。

Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr.的干燥块根，麦冬为百合科沿阶草属植物麦冬Ophiopogon japonicus (L. f) Ker-Gawl.的干燥块根，天花粉为葫芦科栝楼属植物栝楼

Trichosanthes kirilowii Maxim.的干燥根，黄芩为唇形科黄芩属植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，知母为百合科知母属植物知母Anemarrhena asphodeloides

Bge.的干燥根茎，荷叶为睡莲科莲属植物莲Nelumbonucifera Gaertn.的干燥叶，人参为五加科人参属植物人参Panax ginseng C. A. Mey.的干燥根和根茎，甘草为豆科甘草属植物甘草

Glycyrrhizauralensis Fisch.的干燥根和根茎，经实验室阮佳研究员按《中国药典》2020年版检测炮制后符合要求。采用随机数字表法将不同批次饮片进行组合，结果见表2。

2 方法与结果2.1 色谱条件MS Technologies Target-Core C18色谱柱（100 mm×4.6 mm，2.7 µm）；流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱：0～5 min，2%乙腈；5～15 min，2%～6%乙腈；15～30 min，6%～9%乙腈；30～65 min，9%乙腈；65～70 min，9%～14%乙腈；70～85 min，14%～16%乙腈；85～95 min，16%～17%乙腈；95～105 min，17%乙腈；105～115 min，17%～20%乙腈；115～120 min，20%～27%乙腈；120～140 min，27%～33%乙腈；140～141 min，33%～90%乙腈；141～142 min，90%乙腈；体积流量1.0 mL/min；进样量10 µL；检测波长254 nm；柱温30 ℃。

2.2 溶液的制备2.2.1 水煎液的制备 二冬汤始载于清代程国彭所著的《医学心悟》卷三，文中记载：“大法，治上消者，宜润其肺，兼清其胃，二冬汤主之…治上消，天冬（二钱，去心），麦冬（三钱，去心），花粉（一钱），黄芩（一钱），知母（一钱），甘草（五分），人参（五分），荷叶一钱，水煎服。

”根据中医药管理局颁布的古代经典名方关键信息表（7首方剂）[13]并查阅相关文献确定，清代一钱等于现今3.73 g，一钱等于十分因方中煎服方法仅有“水煎服”，故参照2009年国家中医药管理局关于印发的《医疗机构中药煎药室管理规范》和有关文献并结合实验室前期实验，确定二冬汤标准汤剂的制备方法：称取天冬11.19 g，麦冬16.78 g，天花粉5.60 g，黄芩5.60 g，知母5.60 g，甘草2.81 g，人参2.81 g，荷叶5.60 g，共55.60 g，加纯净水650 mL，加盖浸泡30 min，武火煮沸后转文火煎煮30 min，药渣再加550 mL水加热煮沸30 min，趁热用100目滤布滤过，合并2次滤液，放冷加自来水定容至1000 mL量瓶中，即得。

2.2.2 混合对照品的制备 精密称取新芒果苷、芒果苷、金丝桃苷、黄芩苷、千层纸素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、甘草酸铵适量于25 mL量瓶中，加甲醇制成质量浓度分别为0.128、0.048、0.040、0.072、0.052、0.048、1.960 g/L的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取“2.2.1”项下制备得到的二冬汤水煎液5 mL，10 000 r/min离心（离心半径5 cm）10 min，取上清液过0.24 µm水相微孔滤膜，即得供试品溶液2.3 方法学考察。

2.3.1 稳定性试验 取同一水煎液（S1）供试品溶液，分别在制样后0、2、4、8、12、24 h后测定，以23号色谱峰为参照峰（S），计算各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.6%，相对峰面积的RSD均小于4%，各图谱相似度均大于0.96，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.2 精密度试验 取同一份水煎液（S1）供试品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，以23号色谱峰为参照峰（S），计算各峰的相对保留时间的RSD均小于0.4%，相对峰面积的RSD均小于3%，各图谱相似度均大于0.96，表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验 取同一水煎液（S1），按照“2.2.3”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，以23号峰为参照峰（S），结果各峰的相对保留时间的RSD均小于0.4%，相对峰面积的RSD均小于5%，各图谱相似度均大于0.95，表明该方法重复性良好。

2.4 二冬汤指纹图谱的建立取15批二冬汤供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行进样检测，记录色谱图采用“中药色谱指纹谱图相似度评价系统（2012版）”进行数据分析，以S1为参照图谱，时间窗宽度设定为0.1 min，采用中位数法，进行多点校正和Mark峰匹配，生成二冬汤指纹图谱及其对照指纹图谱（共有模式，R），结果见图1。

共标定26个共有峰，其中指认7个共有峰，分别为4号峰新芒果苷、6号峰芒果苷、10号峰金丝桃苷、17号峰黄芩苷、21号峰千层纸素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、23号峰汉黄芩苷、26号峰甘草酸铵。

2.5 共有峰归属取二冬汤物质基准样品S1以及缺天冬、缺麦冬、缺天花粉、缺黄芩、缺知母、缺甘草、缺人参、缺荷叶的阴性样品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图。

结合色谱峰的保留时间及紫外吸收图，通过对比分析，对26个共有峰进行归属，见图2结果发现4～7号峰来自知母，11、15～24号峰来自黄芩，1、9、10～14号峰来自荷叶，25、26号峰来自甘草，2、3号峰为知母荷叶共有峰，黄芩在该条件下出峰较多，因天冬、麦冬、天花粉成分大多为多糖类，本身药典也无紫外检测，故在本指纹图谱下无贡献。

2.6 相似度分析以对照指纹图谱为参照，计算15批二冬汤样品图谱相似度分别为0.976、0.976、0.976、0.976、0.999、0.997、0.994、0.997、0.999、0.993、0.981、0.994、0.998、0.995、0.995，相似度良好，均在0.90以上，表明所建立的指纹图谱稳定，可以反应其指纹特征，样品S1～S4、S11相似度小于0.99，表明不同产地、批次之间物质基准存在质量差异。

2.7 HCAHCA常用于数据的初步探索性分析，具有直观、结论形式简明的特点[14]采用SPSS 21.0数据分析软件，对15批样品的共有峰的峰面积进行系统聚类分析，采用组间连接法，测量区间为平方欧氏距离，聚类结果见图3，结果发现当欧氏距离为10时，将15批二冬汤物质基准可分为2类，样品S1、S5、S9、S11、S15为第1类，样品S2～S4、S6～S8、S10、S12～S15为第2类，表明不同产地间药材质量存在一定的差异性。

2.8基于成分-靶点-通路的网络药理学分析2.8.1 基于可测性和可溯性的候选化合物筛选 根据相关文献研究，黄芩主要成分为多糖和黄酮类，黄芩的质量控制指标黄芩苷在控制高血糖中发挥重要作用，其可以通过增加人体谷胱甘肽过氧化酶（glutathione peroxidase，Gpx）活性，降低三酰甘油与总胆固醇水平，从而改善人体血糖，汉黄芩苷也为其黄酮类成分，具有抗炎、保护心脑血管等作用

[15]知母的主要成分为皂苷、双苯吡酮类、生物碱类，知母的质量控制指标芒果苷和其他成分如新芒果苷具有良好的降血糖作用[16]甘草主要成分为三萜类、黄酮类、多糖类等其它成分，甘草的控制指标甘草酸具有较好的降血糖、调节免疫和抗动脉粥样化作用。

[17]荷叶的主要活性成分为生物碱和黄酮类，金丝桃苷具有调脂作用[18]天冬、麦冬、人参主要活性成分为皂苷和多糖类，天花粉的活性成分为多糖类结合文献研究和指纹图谱研究，以上6个成分均可以得到指认和测定，且能够实现饮片到物质基准对应实物的传递。

基于可测性和可溯性，将以上6个化合物作为候选化合物利用NCBI数据（https://www.ncbi.nlm. nih.gov/）查找这6个候选化合物的Canonical SMILES，为后续研究做准备。

2.8.2 二冬汤主要化学成分的靶蛋白预测 将6个活性成分的Canonical SMILES分别输入Swiss Target Prediction 数据库（https://www.swisstarget prediction.ch/）进行其对应靶蛋白的预测，将相关靶蛋白进行整理，去除重复靶点，共得到6个活性成分作用的252个靶点。

2.8.3 蛋白-蛋白相互作用（protein-protenin interaction，PPI）网络构建 将通过筛选得到的252个靶点导入在线数据库STRING（http://string-db. org）进行PPI网络构建，选择物种为“Homo sapiens”，蛋白交互评分值“high confidence＞0.9”，并隐藏无联系的节点，其余参数设置保持不变，得到242个靶蛋白的PPI网络图（图4）。

将PPI的分析结果以TSV文本格式导入Cytoscape 3.7.1软件中，并利用其中的“Network Analyzer”功能对分析结果进行拓扑属性分析，选取计算选取度值（degree）、介数中心性（betweenness centrality）和接近中心性（closeness centrality）3个拓扑参数均大于中位数且度值≥10的靶点作为关键靶点。

经过筛选共得到21个关键靶点，结果见表3

2.8.4 基因本体（GO）功能富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析 利用David6.8数据库（https://david.ncifcrf. gov/）对筛选得到的22个关键靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。

GO功能分析和KEGG通路分析均选取“P≤0.01”和“Eenjamini≤0.01”，具有统计学意义GO功能分析共得到49个条目，其中生物过程（biological process，BP）占28条，细胞组成（cell composition，CC）占3条，分子功能（molecular function，MF）占18条。

选取部分显著性强的进行展示，见图5，BP主要包括蛋白质生成、RNA多聚酶促转录因子的转录调节（egulation of transcription from RNA polyerase prometer）和酶结合等方面；CC主要涉及质膜、ATP结合等过程；MF主要涉及胞浆、凋亡过程的负调控等方面。

KEGG富集分析共得到条56通路选取部分显著性强的进行展示，见图6根据显示结果可知，二冬汤的活性成分富集的通路主要包括癌症、Ras相关蛋白1（Ras-associated protein 1，Rap1）信号通路、肝炎等信号通路。

2.8.5 成分-靶点-网络的构建 根据筛选得到的6个成分、21个关键靶点和56条通路导入Cytoscape 3.7.1软件，建立二冬汤“成分-靶点-网络”网络图，结果见图7，由图可知，二冬汤作用于多个靶点、多条通路发挥作用。

2.8.6 Q-Marker的分析 二冬汤在临床上应用较为广泛，可被用于治疗糖尿病、百日咳、肺结核、慢性支气管炎、阴虚咳嗽等，尤其在治疗糖尿病相关症状中具有显著疗效[19-22]网络药理学分析结果可知，二冬汤中6个成分可能作用于蛋白酪磷酸酶N1（PTPN1）而影响蛋白酪磷酸酶1B（PTP1B）编码，而PTP1B是去磷酸化胰岛素信号传导途径中信号分子磷酸化的酪氨酸残基，进而影响胰岛素信号传导。

[23]；白细胞介数- 2（IL-2）是炎症因子，在炎症调控中起作用；胰岛素受体（INSR）分泌胰岛素促进组织、细胞对葡萄糖的摄取与利用，调节血糖水平；表皮生长因子受体（EGFR）是表皮生长因子和转化生长因子-α（TGF-α）的受体，活性成分与该通路相互作用阻断促炎因子和EGFR的结合发挥抗炎作用，增加机体免疫功能

[24]生长因子受体结合蛋白2（GRB2）通过被促红细胞生成素肝细胞受体A2（EphA2）调控参与肝细胞侵袭[25]在GO功能富集分析显示，二冬汤对蛋白质生成、RNA多聚酶促转录因子的转录，酶结合等途径具有广泛的调节作用。

在KEGG富集的通路中，二冬汤主要调节癌症、炎症、免疫等信号通路叉头框蛋白O（FoxO）通路能够通过调节细胞增殖、凋亡、自噬以及氧化应激等反应发挥生物作用，从而影响靶基因葡萄糖6-磷酸酶（G6ase）和磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶（PEPCK）表达，进而抑制肝脏糖异生，改善2型糖尿病大鼠血糖异常。

[26]磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）通路是细胞中一个典型的信号通路，该条通路与磷脂酰肌醇和PTK介导衍生信号通路有关，其能刺激胰岛素对葡萄糖的摄取与储存[27]，Rap1是一种能够调控细胞黏附、细胞极性和细胞-细胞连接形成等多种生物过程的小三磷酸鸟苷环水解酶（GTPase），可以通过调控下游Akt、PI3K因子改善血糖水平。

[28]由此可知，网络药理学的预测结果与已有文献报道较为一致，说明该研究方法具有一定的准确性和可取性同时，这6个有效成分可通过作用于多靶点，干预多条通路发挥药效作用，进一步说明指纹图谱所选的指标成分具有合理性。

这6个成分可以从饮片-煎液实现良好的传递和溯源，且无阴性干扰，基于Q-Marker的五原则，新芒果苷、芒果苷、金丝桃苷、汉黄芩苷、黄芩苷、甘草酸铵都基本符合，故可初步预测其为二冬汤潜在的Q-Marker。

3 讨论中药复方成分复杂，为对其质量进行全面控制，本实验分别考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液5种不同的流动相下色谱峰的分离情况，结果发现流动相为乙腈-水、甲醇-水时，峰较少，流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液时，峰数量接近，但乙 腈-0.1%甲酸水溶液系统各峰分离效果好，故选择乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相。

同时，对203、230、254、270、290 nm等不同检测波长进行了考察，通过比较发现203 nm和230 nm基线漂移严重，270 nm和290 nm与254 nm相比较，254 nm中指标性成分甘草酸铵峰面积更高，故选择254 nm。

另外，考察了色谱柱温度（25、30、35 ℃），体积流量（0.8、1.0、1.2 mL/min）及不同类型色谱柱，最终确定上述色谱条件本研究采用HPLC法建立二冬汤的指纹图谱，筛选出26个共有峰，并对7个峰进行了指认，经与各单味药阴性色谱图对照，得到知母、荷叶、黄芩、荷叶4味饮片的特征峰，其中来源于黄芩的色谱峰较多，天冬、麦冬、天花粉主要成分为多糖和皂苷类，不具备紫外检测的特点，通过课题组前期实验，这4味药可通过薄层或分光光度法进行鉴别。

采用相似度评价软件结合聚类分析，将15批药材分为2类，说明不同产地的药材因气候、海拔等原因会造成一定的差异指纹图谱作为质量控制的手段之 一，还需结合多指标成分的含量测定、出膏率、大类成分含量测定等方法对经典名方质量进行全方位控制。

中药质量是影响中药事业发展的关键因素，Q-Marker基于中药化学成分与中药安全性、有效性，选择中药中一些可测性成分作为质量控制指标，提高中药可控性和溯源性，促进中药质量的控制研究本实验基于Q-Marker可测、特有、有效、传递及配伍“五原则”，首先采用高效液相色谱法建立标准汤剂的指纹图谱，并指认出相关峰，预测出二冬汤可能的质量标志物，体现中药质量的可测性。

随后采用网络药理学的方法从有效性方面对6个可能的标志物成分进行靶点预测及相关通路的富集，其主要涉及蛋白酪磷酸酶N1、INSR、EGFR等21个靶点，富集的通路包括FoxO通路、PI-3K-AKT等56条信号通路，且涉及的靶点和通路大多与治疗糖尿病相关症状相关

[29-30]，这与古方记载“治疗上消”一致，因为糖尿病属于上消范畴但网络药理学仍存在一些局限性，后续仍需要通过一些药理实验进行验证以促进二冬汤质量标准的建立综上所述，本实验基于指纹图谱和网络药理学研究表明新芒果苷、芒果苷、金丝桃苷、黄芩苷、汉黄芩苷、甘草酸铵这6个成分可能为二冬汤的潜在Q-Marker，为二冬汤质量控制及后续研究提供了参考。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突参考文献（略）来 源：帅丽霞，陈 旺，袁 袁，阮 佳，詹 雁，徐超群．基于指纹图谱和网络药理学对经典名方二冬汤质量标志物（Q-Marker）预测分析 [J]. 中草药, 2022, 53(18): 5682-5691 .