常量(常量微量痕量的范围)硬核推荐

摘要：有害物质痕量残留分析不同于常规的常量或微量分析，对于分析技术要求较高。进一步规范该类分析工作，做好实验室质量控制，是保证分析结果的准确与可靠的重要前提。

 

摘要：中药中有害物质痕量残留分析不同于常规的常量或微量分析，对于分析技术要求较高进一步规范该类分析工作，做好实验室质量控制，是保证分析结果的准确与可靠的重要前提本文以最新版美国药典（USP37-NF32）通则和 为基础，介绍了分析方法转移、验证和认证的内容，讨论了三者之前的联系与区别，重点探讨了对于中药痕量分析的参考意义及技术要求。

中药外源性有害残留物分析多属于痕量分析范畴，目前我国主要依赖于药典及相关标准的分析方法进行检测分析但由于实验室环境、试剂和检测指标的不同，且样品基质种类多样，干扰情况复杂[1]，必须建立适宜的分析质量保证体系以保证测试数据的准确可靠。

目前，中国药典等法定标准中收录的中药中外源性有害物质残留分析方法多为通用性检测方法，为了达到预定的准确度和稳定性，分析不同基质的中药时，可能遇到不同的情况，如：采用药典方法分析非药典品种，开发新的分析方法，第 1 次使用药典等法定方法，超出范围使用药典标准方法，将非标方法从一个实验室转移到另一个实验室等，这些情况下所采用的技术手段和分析步骤必须事先规划并进行分析方法的转移、验证或确认，建立可行的标准操作规程并在所有环节严格执行。

本文以最新版美国药典（USP3 7-NF32）中通则（General Chapter）[2]1155[2]1157[2]1162为基础，并参考国外相关规范，针对行业对现代分析方法质量控制中的“转移（transfer）”、“确认（validation）”和“验证（verification）”等术语流于形式及使用的不规范状况，探讨分析方法转移、确认和验证等术语含义的相互联系及区别，重点探讨了三者对于中药痕量分析的参考意义及技术要求，强调中药及天然药物质量控制正确应用这些技术要求的重要性，供同行讨论参考。

1分析方法转移（transfer）分析方法转移，也称作方法转移，该程序就是记录一个实验室（接收方）能够使用由另一个实验室（转移方）所开发检验方法的过程，并确保接收实验室具有相关知识和能力，能够按预期进行分析方法转移。

分析方法的转移可以通过以下几种方法来实现，包括：比对试 验、实验室间共同验证、再认证和转移豁免等2分析方法的验证（validation）当开发一 种新的分析方法，更 改药典分析方法时，或将已确立的标准方法用于非药典品种分析时都应进行方法验证，其特性参数包括准确度、精密度、专属性、灵敏度、线性、范围、耐用性等。

分析方法的准确度（accuracy）是真实值或认可的参考值与测 量值之间相近的程度精密度（precision）是指规定条件下对均质样品多次取样所得一系列检测结果的接近程度，一般用测量结果的标准偏差（SD）或者相对标准偏差（RSD）表示。

专属性（specificity）定义为在其他成分（如杂质、降解产物、辅料等）可能存在下，采用的方法能够正确地测定出被分析物的特性鉴别试验、纯度测定、含量测定等方法均应考察其专属性灵敏度（sensitivity）通常以定量限（limit of quantitation，LOQ）和检出限（limit of detection，LOD）来表示。

范围（range）系指能够达到一定精密度、准确度和线性，试验方法使用的高低限量的区间线性（linearity）系指在一定范围内，试验结果与试样中被测物浓度成正比关系的程度耐用（robustness）系指在测定参数有微小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，体现了其分析方法的适用性。

药典测试的要求差别较大，从高精度的分析测定到属性的主观评估美国药典（USP37-NF32）规定了不同的分析测定方法应当对应不同的验证方案，见表1[2]1157Ⅰ类：原料药主要成分或制剂活性成分的含量测定；Ⅱ类：杂质的含量和限度测定；Ⅲ类：性能特点（如溶出度和释放度）的测定；Ⅳ类：鉴别反应。

表1.  各类别对应验证内容验证特性参数Ⅰ类Ⅱ类Ⅲ 类Ⅳ 类定量限度准确度是是**否精密度是是否是否专属性是是是*是检测限否否是*否定量限否是否*否线性是是否*否范围是是**否  * 取决于具体检测项目

3分析方法的确认（verification）分析方法的确认是评价在实际条件下，使用指定的样品以及操作方法是否可用于其预期目的USP37-NF32规定如果标准操作方法的确认失败，并且美国药典委员会的协助也未能解决问题，则可断定此方法不适用于该供试品用于该实验室。

评估标准分析方法在实际条件的适用性，不一定需要对于表 1 中列出的每一分析特性参数都进行实际操作评估，取决于使用者所受的训练和经验水平、方法类别和其相关设备与仪器、具体的操作步骤以及所用的供试品等，USP37-NF32 规定日常操作的药典基本试验方法包括：干燥失重、炽灼残渣、多种湿化学操作（比如酸度）无需确认。

4分析方法验证和确认的联系和区别分析方法转移是针对非标准方法，是评价接收方是否有具有相关知识和能力，使用由转移方所开发的操作方法，并产生稳定、可靠结果的过程知识转移与共享是技术进步的关键要素合格的方法转移程序是保证接收方完全能够产生可靠的结果，从而实现实验室质量控制的重要前提。

验证是对非标准方法、向药典提交的拟定方法、更改的标准方法，或将已确立的标准方法用于非药典品种的验证；确认是使用药典方法时确认该方法在实验室实际使用条件下的适用性两者的目的是不同的，验证是对方法的适用性进行检查和认可，确认则是验证实验室是否有能力执行标准方法。

两者的不同之处见表 2表2.  确认和验证的区别层次确认验证对象药典方法、标准方法非标方法或拟修改的标准方法目的实验室能力的指标方法的指标要求可根据情况选择部分特定参数一般需要覆盖全部特性参数在以往的实验室质量控制中，非标准方法的验证比较受重视，而忽视了对标准方法的确认。

世界卫生组织（World Health Organization，WHO）等分别在不同层次的法规中制定了具体的验证定义[3-8] ，有的侧重分析方法，有的侧重于过程无论实验室对某个标准的执行能力有多强，首先要通过特性参数提供客观依据来表明这个执行能力的程度。

所以，对标准方法的确认过程可以说是必不可少的，中药痕量分析更需如此实验室间比对试验的结果表明，各实验室在执行标准方法所得到的结果往往出现出人意料的偏离除了各实验室的条件、能力有差异，其中的重要原因就是没有对标准方法进行有效地确认过程。

5药痕量残留检测中的分析方法转移、验证与确认的特点中药中外源性有害残留物分析包括重金属及有害元素、农药、真菌毒素、有机污染 物残留量分析等[9]随着以中国药典 2015 年版为代表的法定标准不断完善，中药中有害物质残留检测已成为药检系统常规检验工作之一。

由于这些分析多属于痕量分析范畴，分析成本较高，而且检测指标繁多，样品基质种类多样，干扰情况复杂，因此必须保证所采用的通用分析方法在具体品种分析上的适用性✤ 5.1 中药痕量残留检测中的分析方法转移中药痕量残留分析中，转出方通常是研发部门，负责提供分析方法、标准物质、验证报告。

接收方可以是质量控制部门、公司内部的其他部门、其他公司如委托研发机构痕量残留分析方法转移需考虑以下因素：由于痕量分析技术要求较高，在方法转移前，接收方应确保拥有具备适当资质的人员或在方法转移前对人员进行适当的培训，确保仪器设备都根据需要进行合适的校准和确认，并确定实验室体系符合相应法规和实验室内部管理程序要求。

方法转移选择1 个批次样品即可，因为方法转移的目的与生产工艺无关，而是为了评估分析方法在接收方是否可行 ✤ 5.2 中药痕量残留检测中的分析方法验证 5.2.1 痕量残留检测的准确度痕量残留分析方法的准确性以回收率试验结果表示，或以工作对照品进行分析质量控制。

用于回收率试验的样品以基质相同、不含待测物的空白样品为最好，如果样品中含有较高浓度的待测物，进行回收试验时往往误差被放大，难以得到真实可信的回收率进行回收率试验时不必减量取样，这样能够更好地反应基质对测定的影响。

加标浓度一般选择在最大残留限量附近，对照物质必须在取样后立即加入，否则难以反应整个提取、净化、测定过程的回收情况以标准物质作为分析质量控制，可以取代随行回收试验标准物质建议选择法定有证标 准物质，其基质应与待测供试品相同或接近，相关检测指标的含量也应在校准线性范围内。

5.2.2 痕量残留检测的精密度 精密度可从以下 3个层次考虑：重现性（reproducibility）系指在不同实验室，使用该分析方法测定结果之间的精密度；中间精密度（intermediate precision）系指在同一实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果之间的精密度；重复性（repeatability）系指在同一实验室，在较短的时间间隔，由同一分析人员使用相同的实验设备测定所得结果的精密。

建议重复性在规定范围内，至少用 9 个测定结果进行评价例如设计 3种不同浓度，每种浓度下分别制备 3 份供试液；或是将同一浓度 的供试液，用至少测定 6 次的结果进行评价在痕量残留分析中，由于样品中待测成分的含量很低，因此使用样品进行的精密度分析通常意义不大。

很多时候，会以回收率试验中的 RSD  结果代替精密度试验5.2.3 痕量残留检测的专属性由于痕量残留检测中空白或样品基质都可能对测定带来较大的干扰，因此排除假阳性或 假阴性结果，保证结果的专属性是保证分析质量的必须要求。

得到肯定的阳性结论要基于以下条件：1）空白试验符合要求；2）准确度试验符合要求；3）阳性验证符合要求得到肯定的阴性结论要基于以下条件：1）灵敏度试验符合要求；（2）准确度试验符合要求采用色谱法时，可更换不同极性色谱柱，比较全扫描光谱，更换更具专属性 的检测方式等。

并且应附代表性图谱以说明物质专属性，应标明各成分的峰，必要时可以进行峰纯度检测采用质谱法检测，可提供更为有力的证据5.2.4 痕量残留检测的灵敏度灵敏度是衡量一个痕量残留检测方法可行性、先进性的重要指标之一，反应了该方法能够定量测定样品中待测成分的最低量的能力。

检出限可分为仪器检出限和方法检出限对于具有背景噪音的仪器分析 方法，可采用信噪比法，即把已知低浓度的供试液测出的信号与空白样品测出的信号进行比较一般对于检出限而言，可接受的信噪比为 2∶1 或 3∶1；对于定量限则为 10∶1。

还有的方法是依据校正曲线的斜率测定值及响应值的标准偏差然而，方法验证过程中，仪器的检测能力不能代表方法的灵敏度通常，需要采用相同的样品基质，在含有极低浓度的待测物，或者加入极低浓度的待测物的情况下，通过样品前处理和分析测定，确定方法检出限和定量限。

5.2.5 痕量残留检测的线性和范围 痕量残留分析区别于一般含量测定，由于样品中待测物质含量可能是处于从没有到含量较高的一个较宽的范围中，因此线性和范围的确定是痕量残留检测分析方法建立的关键技术环节之一，不但应满足仪器灵敏度和性能要求，还应满足风险评估的技术需要。

在进行线性测定时，通常至少使用 5 个浓度的对照品溶液浓度和测定结果可以进行数学转换（包括对数、平方根、倒数等），回归分析出相关系数、y 轴截距、回归函数线的斜率和残差平方和回归直线的斜率和它的变化提供了线性的数值大小，而 y 轴的截距则表明了潜在的方法偏差的大小。

线性范围应尽量覆盖预期的浓度范围，浓度点在每一个数量级范围内通常至少应为 3 个建立分析方法时，有必要考虑最大残留限量（maximum residue level，MRL）的可能浓度，MRL 所处的供试品溶液浓度应包含在线性范 围以内。

一般要求，最低校准浓度（lowest calibrated level，LCL）不得高于检测限，所对应的供试品溶液中待测物浓度应≤ 1/10 MRL（当MRL ≥ 0.1 mg・kg  时），或≤ 1/3 MRL（当 MRL ＜0.1 mg・kg  时）。

最大残留限量所对应的供试品溶液浓度应在校准曲线的中间或偏上浓度位置校准曲线最高浓度可根据样品中待测物的可能残留量设置为 MRL 的 2~10 倍✤ 5.3　中药痕量残留检测中的分析方法确认首次采用药典等法定方法进行特定中药品种检验时，应进行分析方法的确认，采用该种样品测试专属性、线性、灵敏度、准确度、精密度等数据，并形成文件性证据。

特别需要注意的是，痕量残留检测中基质效应是干扰分析结果准确性的重要因素之一，在分析方法校准的考察中必须予以高度重视通常可通过比较空白样品溶液加标与采用纯溶剂配制的同样浓度的对照品溶液的测定值（基质因子）确认基质效应的有无及强弱。

由于痕量残留分析中待测物浓度通常在万分之一以下，样品基质、试剂纯度、实验室环境等因素都可能对结果造成极大影响，在日常分析过程中，除了需要通过分析方法确认了解分析方法的系统误差以外，还需要随时排除不同批次的试剂、水、器皿和环境等带来的随机误差。

因此，采用药典等法定方法在日常检验过程中，也有必要确认该方法适用于本次检验的过程，其结果排除了干扰，是可信的结果6结语分析方法转移、验证和确认三者间既 存在着联系，也相互区别无论是对一个拟变更的药典方法，设计一个全新的方法，将已确立的标准方法用于非药典品种，还是使用一个已认可的药典标准方法，只要实验室开展一个项目的检测，那么就需要对方法进行分析方法转移、验证或确认。

中药与天然药物中外源性有害残留物的控制是一个长期性的复杂问题中药与天然药物痕量检测不同于常量分析，技术复杂且容易受到实验室仪器设备、检测环境、供试品、基质等各种因素的干扰对于中药与天然药物中外源性有害残留检测，建立完善的、严格的分析方法转移、验证和确认程序，是做好分析质量控制，保证得到准确、稳定、可靠的分析数据，打破国外技术壁垒，提高中药用药安全性与有效性的重要前提。

参考文献［1］  戴博，金红宇，田金改，等．中药中外源性有害残留物检测方法研究进展[J]．药物分析杂志，2008，28(6)：1014［2］   SP37-NF32[S]．2014：1155，1157，1162

［3］  ICH Q2(R1)．Validation  of Analytical Procedures：Text and Methodology[EB/OL]．[2012-06-20]．［4］   Guidance  for Industry：Analytical Procedures and Methods Validation：Chemistry，Manufacturing，and  Cont rols  and Documentation[EB/OL]．(2000)[2014-08-01]．

［5］ WHO Technical Report Series 937[EB/OL]．(2006)[2014-08-03]．［6］  OMCL Network of the Council  of Europe Quality Assurance Document：Validation of Analytical Procedures[EB/OL]．(1999)[2014-07-11]．

［7］   General Requirements for the  Competence of Testing and CalibrationLaboratories(ISO/IEC 17025)[EB/OL]．(2005)[2014-07-12]．

［8］   EP 7．1[S]．2011：3［9］  金红宇，戴博，田金改，等．中药中外源性有害残留物的控制[J]．中国药事，2007，21(12)：1013［10］  王京辉，许玮仪，金红宇，等．中药中有害残留物痕量检测分析方法验证原则探讨[J]．药物分析杂志，2012，32(9)：1704