融合蛋白(融合蛋白和重组蛋白的区别)燃爆了

主要试剂配制（1）50×TAEBuffer(pH8.5)：调节pH值至8.5，定容至1L，室温保存。（2）LB液体培养基（800mL）：称量8g

 

主要试剂配制（1）50×TAEBuffer(pH8.5)：调节pH值至8.5，定容至1L，室温保存（2）LB液体培养基（800mL）：称量8g氯化钠，4g酵母提取物和8g胰蛋白胨，加入去离子水，定容至800mL，高温高压蒸汽灭菌30分钟，。

置于4℃冰箱保存（3）抗生素Ampicillin：称量1g的Ampicillin粉末，加入一定量的灭菌超纯水，充分混匀溶解，定容至10mL，然后在超净台工作，用0.22μm过滤器过滤除菌，分装，-20℃冰箱保存。

（4）IPTG诱导剂：称量1g的IPTG粉末，加入一定量已灭菌的超纯水，充分混匀溶解，定容至10mL，然后在超净台工作，用0.22μm过滤器过滤除菌，分装，-20℃冰箱保存备用。

（5）PBS缓冲溶液：分别称量氯化钾0.2g，磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠2.08g，氯化钠8.0g，加入一定量的超纯水，使其充分搅拌溶解，定容至1L，高温高压蒸汽灭菌30分钟（6）Columnbuffer：20mL1M的Tris-HCl，11.7gNaCl，2mL0.5M的EDTA，用超纯水定容至1L。

（7）Elutionbuffer：10mM麦芽糖加入到Columnbuffer中（8）考马斯亮蓝R-250染色液：称量0.5g考马斯亮蓝R-250粉末并放置于烧杯中，添加250mL的异丙醇（9）5×Tris-甘氨酸缓冲液：称取Tris15.5g，SDS5g，甘氨酸93.825g，溶于800mL超纯水中，定容至1L，实验前用超纯水将其稀释成。

1×备用（10）1.5mol/LTris（pH8.8）1.3mL，10%SDS0.02mL，10%过硫酸铵0.02mL，TEMED0.002mL，上下颠倒充分混匀原核表达重组质粒的构建（1）利用生物软件Primer5.0设计PCR引物，并分别在上游引物5端和下游引物3端加酶切位点和pMal-c2X-NAP-S1、pMal-c2X-NAP-S2、pMal-c2X-NAP-S3和pMal-c2X-NAP-S4的基因PCR。

扩增所用引物见表。

以本实验室保存的重组质粒pET-24b-NAP为模板，分别按照常规PCR条件扩增NAP基因及S1、S2、S3、S4基因。在冰上配制PCR体系，混合均匀，离心，然后进行PCR操作。

在每个扩增的目的基因片段反应液中，取出5μL的PCR扩增产物，同时利用DNA产物纯化试剂盒对PCR反应扩增得到的产物进行产物纯化PCR扩增产物经过1%的琼脂糖凝胶电泳，验证后纯化PCR扩增产物根据PCR产物纯化试剂盒将PCR产物纯化。

利用PCR，采用目的基因NAP的上游引物及S1、S2、S3、S4的下游引物，以纯化的产物为模板。

将PCR产物进行凝胶电泳检测，对目的条带进行割胶回收，使用胶回收试剂盒胶回收NAP-S1、NAP-S2、NAP-S3、NAP-S4基因PCR产物。

培养：加入700μL的LB液体培养基（已预热至42℃），37℃、200rpm，振荡培养50分钟涂布：3000rpm、3分钟离心浓缩菌体，弃上清至剩余液体200μL，重悬混匀，将其菌液均匀涂布于含Amp的LB平板上，37℃培养箱倒置培养16小时。

第二天，观察平板上的克隆情况，平板置于4℃冰箱保存接种环挑取单菌落到加入3mL含有Amp的LB液体培养基的5mLEP管中，将其置于37℃的摇床上，转速150rpm，震荡培养6h，进行菌落PCR验证PCR反应完成后用1％的。

琼脂糖凝胶电泳检测，选取有特异性条带的单菌落菌液进行后续验证。

选取菌落PCR验证正确的单菌落菌液，取70μL加入7mL含有Amp的LB液体培养基中，置于摇床中振荡培养过夜按照说明书步骤，提质粒进行双酶切双酶切体系置于37℃水浴锅中酶切3-6h，酶切完成后用1%的琼脂糖凝胶电泳验证。

参考Axygen质粒小提试剂盒说明书，提取空质粒pMal-c2X①提前一晚，挑取单克隆，添加千分之一Amp，在LB液体培养基中进行摇菌培养，37℃，200rpm，14h②移液枪共吸取5mL的菌液进行离心收集菌体，12000×g，1分钟，离心后弃上清。

③取置于4℃的试剂S1250μL，重悬菌体，吹打均匀，使其无块状菌体④加入试剂盒中试剂S2300μL，轻轻上下颠倒6-8次，裂解菌体3分钟⑤加入350μL的试剂盒中试剂S3，轻轻上下颠倒数次，然后离心12000×g，10分钟。

⑥小心吸取上清，转移至SpinColumn中，套入至2mL的离心管，离心12000×g，1分钟，弃滤液⑦移液枪吸取500μL的试剂W1加入SpinColumn内，12000×g，1分钟离心，弃去滤液⑧移液枪吸取700μL的试剂WashBufferW2加入SpinColumn内，12000×g，1分钟离心，弃去滤液。

重复该步骤⑨12000×g，1分钟离心，然后将SpinColumn转入新的1.5mL离心管内，开盖静置5分钟，挥发乙醇，不宜时间过长，防止DNA遭到损坏⑩移液枪吸取40μL已经60℃预热的灭菌超纯水添加在SpinColumn滤膜中央处，室温静置2分钟，12000×g，1分钟离心洗脱。

最终得到质粒，超微量核酸蛋白仪测定其质粒浓度，-20℃保存备用

T4DNA连接酶和连接酶Buffer放置于冰上，向EP管中加入ddH2O、双酶切产物载体pMal-c2X和NAP-S1、NAP-S2、NAP-S3、NAP-S4基因，混匀，置于42℃水浴5分钟后，置于冰上，再加入T4DNA连接酶和连接酶Buffer，置于16℃条件下连接过夜。

连接后第二天进行转化，方法同上转化后第二天进行菌落PCR鉴定，方法同上将鉴定正确的菌扩大培养并提质粒取上述步骤中提取的重组表达质粒pMal-c2X-NAP-S1、pMal-c2X-NAP-S2、pMal-c2X-NAP-S3、pMal-c2X-NAP-S4进行SalI和EcoRI双酶切鉴定。

将双酶切体系置于37℃水浴2h加入2μL10×LoadingBuffer后，进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测将双酶切鉴定正确的pMal-c2X-NAP-S1、pMal-c2X-NAP-S2、pMal-c2X-NAP-S3、pMal-c2X-NAP-S4质粒送至金唯智有限公司进行测序，使用BLAST（

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）比对测序结果，Chromas分析基因序列单峰图谱。

融合蛋白rMBP-NAP-S的诱导表达及鉴定（1）将测序正确的阳性重组质粒pMal-c2X-NAP-S1、pMal-c2X-NAP-S2、pMal-c2X-NAP-S3、pMal-c2X-NAP-S4分别转化至原核表达菌株

E.coliBL21中（2）接种环挑取单克隆菌到含Amp的LB液体内培养，200×g，37℃过夜振荡培养（3）第二天以1：100比例接种于含有Amp的LB培养基，200×g，37℃进行扩大培养利用分光光度计检测菌液OD600值。

（4）当其OD600达到0.6对数生长期，加入已配好的诱导剂IPTG进行诱导处理，使其诱导剂的终浓度为0.4mmol/L200×g，37℃诱导培养4小时（5）9000×g，5min离心菌液，可溶性平衡缓冲液重悬沉淀，。

收集菌体，-20℃保存。另外以E.coliBL21（DE3）和pET24b空质粒作为阴性对照。SDS-LoadingBuffer处理样品，12%SDS-PAGE蛋白电泳分析其融合蛋白表达情况。

融合蛋白rMBP-NAP-S的表达形式与纯化分析（1）挑取单克隆菌接种，200×g，37℃在含有Amp的LB液体培养基过夜振荡培养（2）第二天以1：100比例接种于含Amp的800mLLB液体培养基中，200×g，37℃进行扩大培养约3小时。

当其OD600达到0.6对数生长期，加入已配好的诱导剂IPTG进行诱导处理，使其诱导剂的终浓度为0.4mmol/L200×g，37℃诱导培养4小时（3）收集菌体：分装诱导表达后的菌液，离心弃上清，收集沉淀。

，加入适量已配好的Columnbuffer重悬菌体（4）超声破碎，设置超声细胞破碎仪的功率为150W，超声3秒，间歇3秒，共超声20分钟，其中每超声3分钟，冰浴2分钟，防止超声过热使蛋白变性，超声破碎完成，。

冻存于-20℃（5）表达形式分析，将超声破碎后的溶液进行低温离心，分别收集上清和沉淀，SDS-LoadingBuffer处理样品制备10%SDS-PAGE蛋白胶，90V电泳，分析融合蛋白表达形式（6）用8倍柱体积的Columnbuffer平衡蛋白亲和层析柱，加入菌液上清并使其匀速流出，用12倍柱体积的Columnbuffer清洗柱子，以洗去与柱子不结合的杂蛋白。

用Elutionbuffer洗脱目的蛋白，洗脱过程中使用考马斯亮蓝G-250检测蛋白含量，洗脱至考马斯亮蓝G-250溶液不变色为止收集纯化产物，SDS-LoadingBuffer处理样品制备10%SDS-PAGE蛋白胶，90V电泳，。

检测蛋白纯化结果融合蛋白rMBP-NAP-S透析浓缩（1）经过SDS-PAGE鉴定正确后，将所得蛋白置于处理好的透析袋中，两端用细线系紧以防蛋白外漏，于PBS中4°C过夜透析（2）将变色硅胶置于微波炉中烘干使其充分干燥。

，把透析好的蛋白连同透析袋一起放在变色硅胶中，置于4°C密封过夜，透析结束后将蛋白转移至干净的离心管保存融合蛋白rMBP-NAP-S去除内毒素和浓度测定实验具体方法参考厦门EtEraserTMHP内毒素去除试剂盒说明书和SolarbioBCA蛋白浓度检测试剂盒说明书。

（1）蛋白样品的处理在蛋白样品上样前使用0.45μm的滤膜过滤处理蛋白溶液（2）活化柱子内交联的琼脂糖凝胶组装完实验仪器后，添加试剂盒内已预冷的再生缓冲液至柱子内部进行活化，控制流速缓慢流出，每次添加5mL的缓冲液，一共三次。

（3）平衡亲和树脂添加试剂盒内已预冷的平衡缓冲液，控制流速缓慢流出，每次添加6mL的缓冲液，一共三次（4）上蛋白样品添加已预冷的蛋白溶液，控制流速缓慢流出，收集流出液柱子使用保存液保存于4℃冰箱（5）配制BCA工作液和蛋白样品稀释。

工作液应充分混匀，减少误差，蛋白样品取5倍和10倍进行稀释（6）标准品稀释作标准曲线将标准品按照0、50、100、150、200、300、400、500ng/uL进行操作处理（7）孵育和读数37℃培养箱孵育30分钟，。

酶标仪读取A562nm的数值，作出标准曲线从而计算得出蛋白样品的浓度参考文献[1]Spagnolo,F.and P.Queirolo,Upcoming strategies for the treatment of metastatic melanoma.Arch Dermatol Res,2012.304(3):p.177-84.。

[2]斯璐与郭军,新版中国黑素瘤诊治指南解读.临床肿瘤学杂志,2012.17(02):第172-173页. [3]Miller,K.D.,et al.,Cancer treatment and survivorship statistics,2016.CA Cancer J Clin,2016. 66(4):p.271-89.

[4]Mitra,D.,et al.,An ultraviolet-radiation-independent pathway to melanoma carcinogenesis in the red hair/fair skin background.Nature,2012.491(7424):p.449-53.

[5]Davar,D.,A.A.Tarhini and J.M.Kirkwood,Adjuvant therapy for melanoma.Cancer J,2012. 18(2):p.192-202.

[6]Nelson,B.,A power surge for cancer immunotherapy:antibodies,vaccines,and engineered T cells fuel new optimism.Cancer Cytopathol,2014.122(1):p.1-2.

[7]Hsu,F.J.,et al.,Vaccination of patients with B-cell lymphoma using autologous antigen-pulsed dendritic cells.Nat Med,1996.2(1):p.52-8.